Máy Real Time PCR | Nguyên Lý và Quy Trình Vận Hành

Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật PCR/ Real-time PCR là dựa vào sự khuếch đại đặc hiệu của enzyme Taq Polymerase trên cơ sở sự bắt cặp chính xác của primer vào DNA trong mẫu và các dNTP tự do và sự phát quang của các probe huỳnh quang và tự đó bộ phận ghi nhận tín hiệu sẽ ghi nhận được tín hiệu phát ra từ các probe này. Việc khuếch đại này dựa trên sự khác nhau của nhiệt độ phản ứng và những biến đổi của các thành phần.

Kỹ thuật Real time PCR sẽ được đọc bằng máy Real-time PCR. Máy real time PCR là một thiết bị gồm 2 phần cơ bản đó là phần nhiệt và phần quang và được điều khiển bằng một phần mềm chuyên biệt cho máy.

Máy Real time PCR | Phần nhiệt

Về cơ bản nó là một máy PCR với khả năng luân nhiệt ở nhiệt độ khác nhau trong phạm vi từ 115^oC – 4^oC một cách chính xác và quá trình luân nhiệt này được lặp đi lặp lại từ 30 – 40 chu kỳ.

Công nghệ gia nhiệt hiện nay được đa số các hãng sản xuất áp dụng trên các dòng máy của họ chủ yêu có 3 dòng công nghệ gia nhiệt chính đó là:

Công nghệ gia nhiệt peltier hay còn gọi là block nhiệt công nghệ này bạn có thể hiểu đơn giản là – khi bạn nối hai sợi dây đồng và sắt với nhau, một đầu nhúng vào nước đá, một đầu vào nước sôi, sẽ có sự dịch chuyển của các electron sẽ tạo ra một hiệu điện thế và ngược lại, sự dịch chuyển của các điện tử cũng tạo ra sự thay đổi nhiệt độ. Với công nghệ này thông thường tốc độ gia nhiệt và làm lạnh tương đôi chậm hơn so với các dòng công nghệ khác nó rơi vào trong khoảng 3 – 6^oC/ giây.

Công nghệ gia nhiệt thứ 2 mà hiện nay đang cũng đang được các hãng sản xuất máy real-time PCR áp dụng đó là gia nhiệt bằng khí hay còn gọi là gia nhiệt bằng roto. Có thể hiểu đơn giản là việc gia giảm nhiệt độ của mẫu sẽ được điều chỉnh bằng việc thổi các dòng khí nóng lạnh vào buồng làm việc. Với công nghệ gia nhiệt này thì tốc độ gia nhiệt tương đối nhanh hơn so với công nghệ block nhiệt nó rơi vào khoảng 15 – 20^oC/ giây.

Công nghệ thứ 3 mà hiện nay trên thế giới đang áp dụng mặc dù chưa phổ biến ở Việt Nam đó là công nghệ  sử dụng các tấm vi mạch MBS với tốc độ gia được nhiệt công bố lên đến 1000^oC/ giây. Hiện nay công nghệ nay chưa thực sự phổ biến ở nước ta.

Máy Real time PCR | Phần Quang

Phần quang dùng để ghi nhận (detector) nhiều tín hiệu quang phát ra cùng lúc. Hiện nay có 3 kiểu thu nhận tín hiệu phổ biến như là :Charge Couple Device (CCD Camera), Photomultipiler tube (PMT) và Photodiode.

Công nghệ CCD Camera nó thu nhận thông tin bằng cách phát ra một chùm tia cùng một lúc và ghi nhận tất cả các tín hiệu thu lại được và phần mềm sẽ phân tích tách các tín hiệu quang nhận được.

Công nghệ nhân quang (PMT) thường dùng chung với công nghệ gia nhiệt băng khí  công nghệ này sẽ quét qua từng đáy tube mẫu khi tube mẫu đang quay. Tín hiệu huỳnh quang phát xạ sẽ chuyển đến detector PMT lần lượt của từng giếng, công suất thu nhận dữ liệu lên tới 100 giếng trong 0,15 giây.

Công nghệ Photodiode hiện nay đã rất ít được sử dụng trong các dòng máy Real time PCR hiện đại.

Quy trình vận hành 1 máy Real time PCR

• Thông thường một máy real time PCR sẽ được điều khiển bằng 1 phần mềm điều khiển được cài đặt trên máy tính. Việc thao tác trực tiếp trên máy realtime PCR sẽ rất hạn chế. Đối với mỗi dòng máy khác nhau thì sẽ có một phần mền kèm theo để điều khiển máy Vd: như CFX96 thì có Bio-Rad CFX Maestro, ABI 7500 thì có 7500 software, MIC thì có micPCR, InstaQ96 thì có Insta Q96, Pimer 48 thì Prostudy…..
• Tất cả các phần mền sẽ có đầy đủ các chức năng cài đặt chu trình nhiệt, phân tích và xử lý tín hiệu quang thu được bao gồm cả các chức năng phân tích như HRM – Melting, Standard Cuver, Absolute quantification, Relative quantification, SNP…
• Sau khi thiết lập phản ứng PCR bằng cách Mix các thành phần phản ứng và Spindown xong thì bạn sẽ chuyển qua khâu thiết lập và chạy phản ứng realtime PCR.
• Thông thường bước đầu tiên sau khi mở phần mềm và mở máy lên thì bạn sẽ chọn loại xét nghiệm tương ứng với phản ứng mà bạn xét nghiệm ban đầu ( Định tính hay định lượng, HRM – để phân tích Melting…).
• Sau khi chọn loại xét nghiệm thì các mục tiếp theo bạn cần quan tâm đó là Detector (chọn các kênh cần phần tích), Sample (cài tên mẫu, thông tin về mẫu), Plate (cài đặt vị trí mẫu trên máy so với trên phần mềm), và program (chu trình nhiệt).

Tùy thuộc vào từng dòng máy mà thứ tự các công việc dưới đây có thể khác tuy nhiên đó là những công việc cần thiết khi tiến hành 1 phản ứng real time PCR bằng máy realtime PCR.

• Thứ nhất: theo đó là cài đặt chu trình nhiệt – bạn sẽ nhập các giá trị nhiệt độ và thời gian tương ứng với chu trình nhiệt mà bạn đã thiết kế từ trước, kèm theo các giá trị: Sample Volume, Hot Lid (nếu có), luôn luôn nhớ trong real time PCR có thêm 1 bước ghi nhận tín hiệu quang (là biểu tượng hình máy chụp hình) đây là sự khác nhau giữa chu trình PCR và chu trình real time PCR, cài đặt chu kỳ lặp lại.
• Thứ 2:  Cài đặt Plate (vị trí giếng trên máy) đó là bạn sẽ chọn những giếng cần phân tích trên phần mềm và tương ứng vị trí mẫu mà bạn đặt vào máy. Trong mỗi giếng bạn cần phân tích kênh màu nào thì bạn sẽ nhấp vào vị trí giếng đó và chọn các kênh màu tương ứng cần phân tích. (FAM, HEX, ….). Sau đó là đặt tên cho từng mẫu việc này là tối quan trọng trong kể cả nghiên cứu và xét nghiệm, đừng để việc chuẩn bị một quy trình tách chiết và hóa chất PCR cộng từng ấy thời gian trở nên vô nghĩa chỉ vì bạn quên đánh dấu tên mẫu. Tiếp theo hãy chọn tính chất của từng mẫu trên từng vị trí là mẫu Negative control, Positve control, Standard (nếu có), hay mẫu cần xét nghiệm Unknow.

Sau khi cài đặt xong các vấn đề trên thì bạn bắt đầu nhấn Run hoặc Start để máy bắt đầu chạy và việc của bạn bây giờ là chờ đợi.

Quy trình phân tích kết quả và xử lý kết quả như thế nào thì xin hẹn bạn ở bài viết sau.