Sắc ký là gì? Các kỹ thuật sắc ký được dùng trong thí nghiệm

Sắc ký dựa trên khái niệm hệ số phân vùng. Phân vùng chất tan giữa hai dung môi là bất biến. Ứng dụng của sắc ký dựa trên việc chúng ta tạo một dung môi bất động (bằng cách hấp phụ trên ma trận hỗ trợ rắn) và một thiết bị dịch chuyển. Nếu ma trận hỗ trợ hoặc pha tĩnh là cực như giấy, silica,…thì đó là sắc ký pha thuận còn nếu nó không phân cực (C-18) thì đó là pha ngược lại.

1. Sắc ký là gì?

Sắc ký là một kỹ thuật phòng thí nghiệm để tách hỗn hợp. Hỗn hợp này được hòa tan trong một chất lỏng gọi là pha động, di chuyển qua một môi trường chứa vật liệu khác gọi là pha tĩnh. Các thành phần khác nhau của hỗn hợp di chuyển ở tốc độ khác nhau, khiến chúng tách ra. Sự phân tách dựa trên việc phân vùng khác biệt giữa các pha di động và tĩnh. Sự khác biệt trong hệ số phân vùng của hợp chất dẫn đến sự lưu giữ vi sai trên pha tĩnh, từ đó ảnh hưởng đến sự phân tách.

2. Mục đích sử dụng của sắc ký

Sắc ký có thể là dùng để chuẩn bị hoặc phân tích:

- Sắc ký chuẩn bị được dùng để tách các thành phần của hỗn hợp để sử dụng cho các thí nghiệm sau này, thay vì phân tích. Đây được coi như một hình thức tinh chế.

- Sắc ký phân tích thường được thực hiện với lượng vật liệu nhỏ hơn và để thiết lập sự hiện diện hoặc đo tỷ lệ tương đối của chất phân tích trong hỗn hợp. Cả hai không loại trừ lẫn nhau. 

3. Các thuật ngữ sắc ký

- Chất phân tích là chất cần tách trong quá trình sắc ký. Nó thường là những chất cần thiết phải lấy hỗn hợp ban đầu.

- Sắc ký phân tích được sử dụng để xác định sự tồn tại và nồng độ chất phân tích trong mẫu.

- Pha liên kết là pha tĩnh được liên kết cộng hóa trị với các hạt hỗ trợ hoặc thành trong của ống cột.

- Sắc ký đồ là đầu ra trực quan của sắc ký. Trong trường hợp phân tách tối ưu, các đỉnh hoặc mẫu khác nhau trên sắc ký đồ tương ứng với các thành phần khác nhau của hỗn hợp được tách.

Cột x của sắc ký đồ biểu thị thời gian lưu

+ Trục x vẽ thời gian lưu

+ Trục y vẽ một tín hiệu tương ứng (ví dụ thu được bằng máy đo quang phổ, máy quang phổ khối hoặc các loại máy dò khác) được tạo bởi các máy phân tích thoát ra khỏi hệ thống. 

+ Trong trường hợp hệ thống tối ưu, tín hiệu tỷ lệ thuận với nồng độ của chất phân tích cụ thể được tách ra.

- Máy sắc ký là thiết bị cho phép phân tách tinh vi như sắc ký khí hoặc tách sắc ký lỏng.

- Sắc ký là một phương pháp phân tách vật lý phân phối các thành phần để phân tách giữa hai pha, một pha (pha tĩnh), pha kia (pha động) di chuyển theo một hướng xác định.

- Dịch rửa giải là dung môi mang chất phân tích thuộc pha động rời khỏi cột, chúng ta có thể gọi nó là nước thải.

- Eluite là chất phân tích, chất hòa tan.

- Eluotropic là một danh sách các dung môi được xếp hạng theo sức mạnh rửa giải của chúng.

- Pha bất động là pha tĩnh được cố định trên các hạt hỗ trợ hoặc trên thành trong của ống cột.

Tổng quan về sự phân tách sắc tố của sắc tố quang hợp

- Pha động là pha di chuyển theo một hướng xác định. 

+ Nó có thể là chất lỏng (LC và Điện hóa mao quản (CEC)), chất khí (GC) hoặc chất lỏng siêu tới hạn (sắc ký siêu tới hạn chất lỏng, SFC). 

+ Pha động bao gồm mẫu được tách hoặc phân tích và dung môi di chuyển mẫu qua cột. Trong trường hợp sắc ký cột lỏng cao áp (HPLC), pha động bao gồm dung môi không phân cực như hexane ở pha thường hoặc dung môi phân cực như metanol trong pha ngược của sắc ký và mẫu được tách ra. 

+ Pha động di chuyển qua cột sắc ký (pha tĩnh) và mẫu tương tác với pha tĩnh sẽ được tách ra.

- Thời gian lưu là thời gian đặc trưng để một chất phân tích cụ thể đi qua hệ thống (từ đầu vào cột đến đầu dò) trong các điều kiện đã đặt. 

- Mẫu là nội dung được phân tích trong sắc ký. Nó có thể bao gồm một thành phần duy nhất hoặc một hỗn hợp của các thành phần. 

- Chất tan là các thành phần mẫu trong sắc ký phân vùng.

- Dung môi là chất có khả năng hòa tan một chất khác, đặc biệt là pha động lỏng trong sắc ký lỏng.

- Pha tĩnh là chất cố định tại chỗ cho quy trình sắc ký như silica trong sắc ký lớp mỏng.

- Máy dò là công cụ được sử dụng để phát hiện định tính và định lượng các chất phân tích sau khi tách.

Máy dò giúp phát hiện định tính và định lượng chất sau phân tích

4. Các kỹ thuật sắc ký

4.1. Sắc ký cột

- Sắc ký cột là phương pháp sắc ký phân tách và định lượng sinh chất dưới áp suất cao, giúp giảm đáng kể thời gian và hiệu quả, chất lượng phân tích. 

- Các hạt của pha tĩnh hoặc hỗ trợ được phủ bằng pha tĩnh lỏng có thể lấp đầy toàn bộ thể tích bên trong ống hoặc tập trung dọc theo thành ống phía trong để tạo một đường dẫn mở, không giới hạn cho pha động phần giữa của ống (cột hình ống mở). 

- Sự khác biệt về tốc độ di chuyển qua môi trường được tính theo thời gian lưu khác nhau của mẫu. 

Cách sử dụng sắc ký cột trong thí nghiệm

4.2. Sắc ký Phosphocellulose

- Sắc ký Phosphocellulose sử dụng lực liên kết của nhiều protein liên kết DNA với phosphocellulose.

- Sự tương tác của protein với DNA càng mạnh thì nồng độ muối cần thiết để rửa giải protein càng cao. 

4.3. Sắc ký giấy

- Sắc ký giấy là một kỹ thuật liên quan đến việc đặt một chấm nhỏ hoặc dòng dung dịch mẫu lên một dải giấy sắc ký. Giấy được đặt trong một thùng chứa với một lớp dung môi nông và niêm phong lại. 

- Khi dung môi tăng qua giấy, nó gặp hỗn hợp mẫu và bắt đầu di chuyển lên giấy với dung môi. 

- Giấy này được làm từ cenlluose, một chất phân cực và các hợp chất trong hỗn hợp di chuyển xa hơn nếu chúng không phân cực. Nhiều chất phân cực liên kết với giấy cellulose nhanh hơn, do đó không đi xa được.

Sắc ký giấy được làm từ cenllulose

4.3. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

- Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kỹ thuật phòng thí nghiệm được sử dụng rộng rãi để phân tách các hóa sinh khác nhau trên cơ sở những điểm thu hút tương đối của chúng đối với pha tĩnh và pha động. 

- Nó tương tự như sắc ký giấy. Tuy nhiên, thay vì sử dụng pha giấy cố định, nó bao gồm pha tĩnh của một lớp chất hấp phụ mỏng như silica gel, alumina hoặc cenllulose trên đế phẳng, trơ. 

- TLC thích hợp cho các ứng dụng sàng lọc như kiểm tra nồng độ thuốc và độ tinh khiết của nước bởi khả năng nhiễm chéo thấp vì mỗi lần phân tách được thực hiện trên một lớp mới.

Sắc ký lớp mỏng thích hợp cho các ứng dụng sàng lọc

4.4. Sắc ký dịch chuyển

Nguyên tắc cơ bản của sắc ký dịch chuyển là một phân tử có ái lực cao với ma trận sắc ký (chất dịch chuyển) cạnh tranh hiệu quả cho các vị trí liên kết để thay thế tất cả các phân tử có ái lực thấp hơn. 

5. Mua giấy sắc ký Whatman chất lượng