PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LỌC MÀNG

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 6187 - 1 : 2009

ISO 9308 - 1 : 2000

CHẤT LƯỢNG NƯỚC – PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM ESCHERICHIA COLI VÀ VI KHUẨN COLIFORM –

PHẦN 1 : PHƯƠNG PHÁP LỌC MÀNG

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này mô tả phương pháp làm đối chứng (Phép thử Tiêu chuẩn) để phát hiện và đếm khuẩn E. coli và vi khuẩn coliform trong nước dùng cho sinh hoạt. Phép thử Tiêu chuẩn có độ chọn lọc thấp nhưng cho phép phát hiện cả những vi khuẩn có hoạt tính đã bị yếu. Do độ chọn lọc thấp, sự phát triển của nền mẫu có thể ảnh hưởng tới độ tin cậy của việc đếm vi khuẩn coliform và E.coli ví dụ trong nước uống, nước giếng nông và nước mặt. Phương pháp này không thích hợp cho những loại nước này. Phép thử Tiêu chuẩn dựa trên sự lọc qua màng rồi cấy trên môi trường thạch khác nhau và tính số lượng các loài sinh vật quan tâm có trong mẫu.

Tiêu chuẩn này đặc biệt thích hợp cho những loại nước có số lượng vi khuẩn thấp. Trường hợp đặc biệt cần thông tin nhanh, phương pháp này (Phép thử Nhanh) phát hiện E. coli trong nước dùng cho sinh hoạt chỉ trong 24 h.

Phép thử Nhanh dựa trên sự lọc qua màng, rồi cấy trong điều kiện chọn lọc và tính số E. coli trong mẫu.

Phép thử Tiêu chuẩn và Phép thử Nhanh có thể dùng cho các loại nước khác miễn là chất rắn lơ lửng và thực vật trong nước không cản trở việc lọc, nuôi cấy và đếm.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851-89 (ISO 3696 : 1997) Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử;

TCVN 5992 : 1995 (ISO 5667-2 : 19911)) Chất lượng nước – Lấy mẫu – Hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu;

TCVN 6450 : 2007 (ISO/IEC Guide 2 : 2004) Tiêu chuẩn hóa và các hoạt động có liên quan – Thuật ngữ chung và định nghĩa;

TCVN 6663 – 1 : 2002 (ISO 5667-1 : 19802)) Chất lượng nước – Lấy mẫu – Phần 1: Hướng dẫn lập chương trình lấy mẫu;

TCVN 6507-1 : 2005 (ISO 6887-1 : 1999) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân;

TCVN 6663 – 3 : 2008 (ISO 5667-3 : 2003) Chất lượng nước – Lấy mẫu – Phần 3: Hướng dẫn bảo quản và xử lý mẫu;

ISO 8199 : 19883) Water quality – General guide to the enumeration of micro-organism by culture (Chất lượng nước – Hướng dẫn chung về đếm vi sinh vật bằng phương pháp nuôi cấy).

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này, áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa của TCVN 6450 (ISO/IEC Guide 2) và các thuật ngữ, định nghĩa sau:

3.1. Vi khuẩn dương tính với lactoza (lactose-positive bacteria)

<Phép thử Tiêu chuẩn> vi khuẩn có khả năng tạo thành khuẩn lạc ưa khí ở (36 ± 2) °C trong vòng (21 ± 3) h trên môi trường cấy lactoza chọn lọc khác nhau có sinh ra axit.

3.2. Vi khuẩn coliform (coliform bacteria)

<Phép thử Tiêu chuẩn> vi khuẩn dương tính với lactoza như định nghĩa trong 3.1 là âm tính với oxydaza.

3.3. Escherichia coli

<Phép thử Tiêu chuẩn> vi khuẩn coliform như định nghĩa trong 3.2 sinh ra indol từ tryptophan ở (44,0 ± 0,5) °C trong (21 ± 3) h.

3.4. Escherichia coli

<Phép thử Nhanh> vi khuẩn kháng mật, sinh ra indol từ tryptophan ở (44,0 ± 0,5) °C trong (21 ± 3) h.

4. Nguyên tắc

4.1. Mô tả chung về phương pháp

Phương pháp này dựa trên sự lọc qua màng và gồm hai phần là Phép thử Tiêu chuẩn làm đối chứng và Phép thử Nhanh tùy chọn có thể tiến hành song song như sau. Phép thử Tiêu chuẩn gồm việc ủ màng trong môi trường chọn lọc sau đó lấy đặc trưng sinh hóa của các khuẩn lạc dương tính lactoza điển hình để phát hiện và đếm vi khuẩn coliform và E. coli trong hai ngày đến ba ngày. Phép thử Nhanh gồm hai bước ủ cho phép phát hiện và đếm E. coli trong vòng (21 ± 3) h. Nếu hai cách thử này được tiến hành song song thì kết quả cuối cùng E. coli là cao hơn.

4.2. Lọc và ủ

Phần mẫu thử được lọc qua màng để giữ vi khuẩn. Một màng (Phép thử Tiêu chuẩn) được đặt trên môi trường thạch lactoza được ủ ở (36 ± 2) °C trong (21 ± 3) h và một màng (Phép thử Nhanh) đặt trên môi trường thạch chứa casein (tripxin) được ủ ở (36 ± 2) °C từ 4 h đến 5 h, tiếp theo ủ ở (44,0 ± 0,5) °C từ 19 h đến 20 h trên môi trường thạch casein (tripxin) và muối mật.

4.3. Đánh giá và khẳng định, Phép thử Tiêu chuẩn

Những khuẩn lạc đặc trưng trên màng được đếm là vi khuẩn dương tính với lactoza. Đối với vi khuẩn coliform và E. coli việc cấy thử được tiến hành từ những khuẩn lạc đặc trưng đã được chọn ngẫu nhiên để khẳng định loại sinh ra oxydaza và indol. Đếm số coliform dương tính với lactoza và E. coli có trong 100 ml mẫu.

4.4. Đánh giá và khẳng định, Phép thử Nhanh

Những khuẩn lạc trên màng có khả năng tạo indol từ tryptophan trong môi trường thạch được đếm là E. coli. Đếm số E. coli có trong 100 ml mẫu.

5. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Những thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh và cụ thể là:

5.1. Thiết bị tiệt trùng bằng hơi nước (nồi hấp)

Thiết bị và dụng cụ thủy tinh được tiệt trùng theo hướng dẫn trong ISO 8199.

5.2. Bếp cách thủy và/hoặc tủ ủ, có điều chỉnh nhiệt độ ở (36 ± 2) °C.

5.3. Bếp cách thủy và/hoặc tủ ủ, có điều chỉnh nhiệt độ ở (44,0 ± 0,5) °C.

CHÚ THÍCH Đối với Phép thử Nhanh, có thể dùng lò ủ đặt chương trình thay cho lò ủ 5.2 và 5.3, và đặt ở (36 ± 2) °C và (44 ± 0,5) °C.

5.4. Máy đo pH, với độ chính xác ± 0,1.

5.5. Thiết bị lọc màng, phù hợp với ISO 8199.

5.6. Màng lọc, làm bằng este xenlulô, đường kính khoảng 47 mm hoặc 50 mm, có đặc tính lọc tương đương với màng lọc có cỡ lỗ 0,45 µm và có thể có lưới.

Màng lọc phải không ức chế hoặc kích thích sự phát triển của các khuẩn lạc và mực in lưới trên cái lọc phải không ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn. Nếu màng lọc chưa được tiệt trùng thì cần tiệt trùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mỗi lô màng lọc cần được thử theo ISO 7704 về tính thích hợp cho sự thử, do việc sử dụng các màng lọc có nhãn hiệu khác nhau có thể dẫn đến sự hiện màu khác nhau.

CHÚ THÍCH Màng lọc màu xanh lá cây dùng cho Phép thử Nhanh rất tốt cho việc nhận biết sự hiện màu.

5.7. Kẹp mũi tròn, dùng để kẹp màng lọc

5.8. Đèn cực tím, bước sóng 254 nm (đèn thủy ngân áp suất thấp).

CẢNH BÁO – Ánh sáng UV gây kích thích mắt và da. Sử dụng găng và kính bảo hộ.

5.9. Giá lọc, đường kính ít nhất 47 mm.

6. Môi trường cấy và thuốc thử.

Để chuẩn bị môi trường cấy và thuốc thử, cần dùng hợp phần có cùng chất lượng và cấp độ hóa chất phân tích (xem chú thích) theo hướng dẫn trong Phụ lục B. Cũng có thể sử dụng môi trường và thuốc thử mua ngoài thị trường nhưng chúng phải phù hợp với các thành phần nêu trong Phụ lục B và cần phải theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.

CHÚ THÍCH Có thể dùng hóa chất chất lượng khác nếu các hóa chất này có tính năng như nhau trong phép thử.

Để chuẩn bị môi trường cấy, cần dùng nước cất hoặc nước đã loại ion không chứa các chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn trong các điều kiện thử và phù hợp với TCVN 4851 (ISO 3696).

Trừ khi có quy định khác, môi trường đã chuẩn bị bền ít nhất một tháng nếu được bảo quản trong tối ở (5 ± 3) °C và chống bay hơi.

7. Lấy mẫu.

Lấy mẫu và đưa đến phòng thí nghiệm theo TCVN 6663-1 (ISO 5667-1), TCVN 5992 (ISO 5667-2) và TCVN 6663-3 (ISO 5667-3).

8. Cách tiến hành

8.1. Chuẩn bị mẫu

Để chuẩn bị mẫu lọc và chủng cấy trên môi trường biệt lập, theo hướng dẫn trong ISO 8199 và TCVN 6507-1 (ISO 6887-1). Tốt nhất là bắt đầu phép thử ngay sau khi lấy mẫu. Nếu mẫu được giữ ở nhiệt độ môi trường (trong tối và không quá 25 °C) việc kiểm tra nên tiến hành ngay trong vòng 6 h kể từ khi lấy mẫu. Trường hợp đặc biệt mẫu có thể lưu giữ ở (5 ± 3) °C đến 24 h trước khi kiểm tra.

8.2. Lọc

Lọc 100 ml mẫu (hoặc thể tích lớn hơn, ví dụ 250 ml cho nước đóng chai màng lọc (5.6). Đặt cái lọc lên trên môi trường thạch tương ứng (8.3 và 8.4), đảm bảo không có không khí ở phía dưới.

8.3. Ủ và phân biệt, Phép thử Tiêu chuẩn

Sau khi lọc (8.2) đặt màng trên đĩa aga Lactoza TTC (B.1) và ủ ở (36 ± 2) °C trong (21 ± 3) h.

CHÚ THÍCH 1 Kéo dài thời gian ủ đến (44 ± 4) h có thể cho độ nhạy của phép thử cao hơn và nhất là với những đĩa không hiện rõ các khuẩn lạc điển hình sau (21 ± 3) h.

CHÚ THÍCH 2 Dùng thêm một màng lọc để ủ ở 44 °C có thể khắc phục được vấn đề phát triển nền mẫu.

Kiểm tra và đếm tất cả các khuẩn lạc đặc trưng dương tính với lactoza, nhưng không quan tâm đến kích thước, hiện màu vàng trong môi trường ở dưới màng lọc. Đối với thử oxydaza và indol cần cấy tiếp tất cả các khuẩn lạc đặc trưng thu được, hoặc một số đại diện (ít nhất 10) trên thạch không chọn lọc (B.3) và trên tryptophan (B.2) tương ứng.

Ủ aga không chọn lọc ở (36 ± 2) °C trong (21 ± 2) h và tiến hành thử oxydaza như sau:

- Nhỏ hai đến ba giọt thuốc thử oxydaza mới chuẩn bị (B.5.3) lên giấy lọc.

- Dùng que cấy thủy tinh, gỗ, vòng dây plastic hoặc platin (không dùng dây crom-niken) bởi một phần khuẩn lạc vi khuẩn lên giấy lọc đã được chuẩn bị.

- Màu xanh đậm xuất hiện trong 30 s là phản ứng dương tính.

Ủ ống nghiệm chứa L-tryptophan (B.2) ở (44,0 ± 0,5) °C trong (21 ± 3) h và kiểm tra sự sinh ra indol bằng cách thêm 0,2 ml đến 0,3 ml thước thử Kovac (B.5.1). Mẫu đỏ thẫm trên bề mặt môi trường xác định sự sinh ra indol.

Một số chủng Klebsiella oxytoca cho phản ứng indol dương tính. Để khắc phục kết quả dương tính này, cần thử thêm b- glucuronidaza (E. coli cho phản ứng dương tính còn K. oxytoca cho phản ứng âm tính).

Đếm các khuẩn lạc có phản ứng oxydaza âm tính là vi khuẩn coliform.

Đếm các khuẩn lạc có phản ứng oxydaza âm tính và phản ứng indol dương tính là E.coli.

CHÚ THÍCH 3. Trong những trường hợp đặc biệt, việc nhận biết các vi khuẩn coliform là cần thiết, ví dụ để phân biệt các chủng từ phân hay từ đất/nước.

8.4. Ủ và phân biệt, Phép thử Nhanh

Sau khi lọc (8.2) đặt màng lên trên môi trường TSA (B.3) và ủ ở (36 ± 2) °C trong 4 h đến 5 h. Sau đó đặt màng lên trên môi trường TBA (B.4) và ủ ở (44,0 ± 0,5) °C trong 19 h đến 20 h.

Nếu muốn, có thể kết hợp hai môi trường thạch thành một lớp kép (xem Chú thích B.4). Trong trường hợp đó, đặt màng lọc lên lớp kép mới chuẩn bị gồm TSA (B.3) và TBA (B.4) và ủ ở (36 ± 2) °C trong 4 h đến 5 h và ủ tiếp ở (44,0 ± 5) °C trong 19 h đến 20 h.

Sau khi ủ, đặt màng lọc lên giá lọc (5.9) bão hòa thuốc thử indol (B.5.2) và chiếu đèn cực tím (5.8) từ 10 min đến 30 min phụ thuộc vào sự hiện màu (xem Chú thích 1). Đếm tất cả những khuẩn có màu đỏ trên màng là E.coli.

CHÚ THÍCH 1 Thuốc thử pha trong nước mua ngoài thị trường có thể cho kết quả rõ ràng hơn và nhanh hơn mà không cần chiếu tia UV.

CHÚ THÍCH 2 Sự phân bố không đều của các khuẩn lạc hoặc số đếm quá cao gây nhiễu cho việc phận biệt các khuẩn lạc dương tính với indol do sự khuếch tán màu sang các khuẩn lạc gần kề.

9. Thể hiện kết quả

Dựa vào số khuẩn lạc đặc trưng trên màng lọc (8.3) tính số vi khuẩn E. coli, coliform và nếu cần cả vi khuẩn dương tính với lactoza trong 100 ml mẫu theo ISO 8199. Khi tiến hành song song hai cách thử (Phép thử Tiêu chuẩn và Phép thử Nhanh) như mô tả cho E. coli, kết quả cuối cùng là cao hơn.

10. Báo cáo kết quả

Báo cáo kết quả cần bao gồm những thông tin sau:

a) viện dẫn tiêu chuẩn này;

b) mọi chi tiết để nhận dạng đầy đủ mẫu;

c) kết quả thể hiện theo Điều 9;

d) những sự cố đặt biệt quan sát được trong suốt quá trình phân tích và mọi thao tác không quy định trong phương pháp này có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.

11. Đảm bảo chất lượng

Sử dụng phòng thí nghiệm có hệ thống kiểm soát chất lượng để đảm bảo rằng vật liệu, thuốc thử và kỹ thuật là phù hợp vớp phép thử.